В мае 2000 года на NBC вышел телевизионный автобиографический фильм «Growing Up Brady», в котором Куоко отлично исполнила роль актрисы Морин МакКормик и привлекла к себе внимание прессы и критиков. Не менее успешной была последующая работа актрисы – роль в комедийном сериале «Ladies Man». В марте 2000 года с участием Кейли вышел диснеевский фильм «Меткий бросок». В 2004 году Кейли сыграла девочку-подростка в сериале на ТВ «8 простых правил для друга моей дочери-подростка», а позднее одну из ведущих ролей в мини-сериале «10,5», повествующем о страшной катастрофе в результате землетрясения. В июле 2004 года вышел телефильм «Преступления моды», где исполнительницами главных ролей стали Кейли Куоко и Меган Фокс. В этом же году она появилась в независимом проекте «Debating Robert Lee», где обсуждаются проблемы неблагополучных подростков. В 2004 году Кейли исполнила еще одну главную роль – в фильме ужасов «Возвращение в сонную лощину». В восьмом сезоне культового телесериала «Зачарованные» о сестрах, обладающих магическими способностями, появилась героиня Билли Дженкинс, роль которой исполнила Кейли. Эта роль оказалась одной из самых удачных в карьере актрисы на тот момент. В 2005 году мужской журнал «For Him Magazine» назвал Кейли Куоко номером 77 в списке ста самых сексуальных женщин года, и номером 21 в 2008 году. Осенью 2007 года Кейли начала сниматься в главной роли в комедии «Теория большого взрыва».
Ее героиня – Пенни, красивая, но не особо одаренная в интеллектуальном плане девушка, мечтающая стать актрисой. Она храпит, пользуется ванильным маслом вместо духов и абсолютно игнорирует правила дорожного движения. Все комичные ситуации строятся на отношениях между учеными Леонардом (роль исполняет Джонни Галецки) и Шелдоном (Джим Парсонс). В январе 2007 года на канале Lifetime вышел фильм «Быть толстым, как я», где Куоко исполнила ведущую роль. Помимо этого она снялась в роли Саши в драматическом сериале «Побег» (эпизоды «Сообщение» и «Чикаго»). В 2008 году актриса исполнила ведущую роль в черной комедии «Зимние мертвецы». В апреле 2011 года в Британии и США состоялась премьера анимационного фильма «Бунт ушастых», где Куоко исполняет роль Саманты. Кейли – исполнительница роли Ванды в фильме 2011 года «Последняя поездка».
На 2012 год с участием актрисы запланирован выход фильма «Суррогат». Так же звезда «Теории большого взрыва» , которая прошла 7 августа 2011 года. В этом году сериал «Теория большого взрыва» получил три номинации на эту награду и.
